ПробоподготовкаЭтап пробоподготовки образца отличается в зависимости от вида биоматериала:
a) При работе с осадком сперматозоидов:
Пробоподготовка не требуется, перейти к этапу лизиса.
b) При работе с образцами семенной жидкости:
Внести в пробирки объемом 1,5-2 мл 30-300 мкл образца. Центрифугировать пробирки в течение 5 минут при 13 тыс. об/мин, аккуратно, не задевая осадок, полностью удалить супернатант.
c) При работе с образцами семенной жидкости, контаминированными чужеродными клетками (эпителий влагалища, буккальный эпителий и др.):
1) В пробирки объемом 1,5-2 мл поместить исследуемые образцы, добавить 200 мкл лизирующего буфера 1 и 20 мкл Протеиназы К. Интенсивно перемешать образцы на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования. Инкубировать образцы при 60°C в течение 15 минут, перемешивая каждые 3-5 минут. Затем центрифугировать образцы в течение 5 минут при 13 тыс. об/мин, аккуратно, не задевая осадок, полностью удалить супернатант.
2) Повторить пункт 1.
3) Добавить к полученным осадкам 400 мкл лизирующего буфера 1. Интенсивно перемешать образцы на вортексе. Центрифугировать пробирки в течение 5 минут при 13 тыс. об/мин, аккуратно, не задевая осадок, полностью удалить супернатант.
Лизис1. К осадкам сперматозоидов добавить 450 мкл лизирующего буфера 2, 20 мкл Протеиназы К и 2 мкл стабилизатора. Вортексировать образцы до полного разрушения конгломерата клеток, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
2. Инкубировать образцы в термостате при 60°C в течение 1-2 часов, периодически перемешивая.
3. Перенести пробирки на лед или в холодный штатив и инкубировать в течение 1 минуты. В случае отсутствия охладительных элементов инкубировать при комнатной температуре в течение 5-10 минут до полного остывания смеси.
Депротеинизация и осаждение НК1. Добавить в пробирки 75 мкл осаждающего буфера 1.
2. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
3. Инкубировать образцы в течение 3-5 минут во льду или в холодном штативе. В случае отсутствия охладительных элементов инкубировать при комнатной температуре в течение 5-10 минут.
4. Центрифугировать пробирки в течение 5 минут при 13 тыс. об/мин.
5. Аккуратно, не задевая осадок, перенести 500 мкл супернатанта в новую пробирку объемом 1,5-2 мл.
6. Добавить к образцам 500 мкл осаждающего буфера 2 и перемешать с помощью пятикратного переворачивания пробирки.
Опционально:a) для увеличения выхода ДНК рекомендуется инкубировать образцы в морозильной камере при -20°C в течение 25 минут;
b) для облегчения визуализации образующегося осадка НК возможно использование соосадителя НК (#sat RaissolТМ).
7. Центрифугировать пробирки в течение 5 минут при 13 тыс. об/мин, после чего удалить супернатант, не задевая осадок.
Промывка НК1. Добавить в пробирки 700 мкл промывочного буфера 1.
2. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе.
3. Центрифугировать пробирки в течение 5 минут при 13 тыс. об/мин, аккуратно, не задевая осадок, удалить супернатант.
4. Добавить в пробирки 700 мкл промывочного буфера 2.
5. Повторить пункты 2,3.
6. Высушить образцы с открытыми крышками в термостате при 42°C или в центрифуге-концентраторе при 30°C до полного испарения промывочного буфера.
Элюция НК1. Добавить в пробирки 50 мкл элюирующего буфера.
2. Инкубировать образцы в термостате при 55-60°C в течение 5 минут, периодически перемешивая на вортексе.
