Проведение процедуры выделения ДНК
Пробоподготовка1. Этап пробоподготовки образца отличается в зависимости от вида биоматериала:При работе с мукой:1.a. Внести в пробирку объемом 1,5-2 мл 50 мг навески образца, добавить 500 мкл лизирующего буфера и 20 мкл Протеиназы К.При работе с семенами:1.b. Измельчить образцы до состояния муки мелкого помола. Внести в пробирку объемом 1,5-2 мл 50 мг навески, добавить 500 мкл лизирующего буфера и 20 мкл Протеиназы К.При работе с проростками:1.c. Поместить навеску 15-50 мг зеленой части проростка в пробирку объемом 1,5 мл и интенсивно перетереть образец с помощью специального пестика для 1,5 мл микроцентрифужных пробирок до гомогенного состояния. Добавить 500 мкл лизирующего буфера. Внести 20 мкл Протеиназы К. 1.d. Поместить навеску 15-50 мг зеленой части проростка в фарфоровую ступку, добавить 500 мкл лизирующего буфера и 500 мкл буфера для гомогенизации, интенсивно перетереть образец с помощью специального пестика до гомогенного состояния. Перенести 500 мкл гомогената в пробирку объемом 1,5-2 мл. Внести 20 мкл Протеиназы К. Примечание: При работе на автоматическом гомогенизаторе требуемая навеска образца помещается в специальную 1,5-2 мл пробирку с керамическими или металлическими бусинами для гомогенизации. Интенсивность программы гомогенизации должна быть щадящая, не допуская перегревания образцов.2. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.Лизис1. Инкубировать образцы в термостате при 56-60℃ в течение 1-2 часов, периодически встряхивая. Опционально: за 10 минут до окончания лизиса возможно использование РНКазы А любого производителя в количестве, рекомендованном производителем.2. Поместить пробирки на лед или в холодный штатив и инкубировать в течение 3 минут. В случае отсутствия охладительных элементов инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут до полного остывания смеси.Сорбция НК1. Центрифугировать пробирки в течение 5 минут при 13 тыс. об/мин.2. Перенести 300 мкл супернатанта в новые пробирки объемом 1,5 мл.3. Добавить 300 мкл связывающего буфера, интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.4. Перенести весь объем смеси в спин-колонку. 5. Центрифугировать пробирки в течение 1 минуты при 13 тыс. об/мин. Удалить фильтрат из собирательных пробирок.Промывка НК1. Добавить в пробирки 650 мкл промывочного буфера 1.2. Центрифугировать пробирки в течение 1 минуты при 13 тыс. об/мин. Удалить фильтрат из собирательных пробирок.3. Добавить в пробирки 650 мкл промывочного буфера 2.4. Центрифугировать пробирки в течение 30 секунд при 13 тыс. об/мин. Удалить фильтрат из собирательных пробирок.5. Добавить в пробирки 650 мкл промывочного буфера 3.6. Центрифугировать пробирки в течение 30 секунд при 13 тыс. об/мин. Удалить фильтрат из собирательных пробирок.7. Повторить п 5-6.8. Вернуть колонки в собирательные пробирки. Центрифугировать пробирки в течение 1 минуты при макс. об/мин. Элюция НК1. Перенести спин-колонки в новые пробирки объемом 1,5-2 мл. Собирательные пробирки утилизировать.2. Нанести на мембрану спин-колонок 50-100 мкл элюирующего буфера. Инкубировать в течение 5 минут. 3. Центрифугировать пробирки в течение 30 секунд при макс. об/мин.4. Утилизировать спин-колонки.Опционально: для повышения выхода НК фильтрат необходимо повторно нанести на мембрану колонки и/или использовать нагретый до 60-70℃ элюирующий буфер.Полученные растворы нуклеиновых кислот могут храниться до 7 дней при температуре от +2℃ до +4℃ и до двух лет при температуре -20℃. По соотношению показателей поглощения на А260/А280 чистота полученного раствора ДНК соответствует ≥1,7.
вернуться в каталог товаров
