Набор реагентов для выделения плазмидной ДНК из бактериальной культуры «Plasmidex Midi»

В набор включены все необходимые реагенты для выделения плазмидной ДНК:
1.        Ресуспендирующий буфер – для разрушения конгломерата клеток;
2.        Лизирующий буфер – на основе хаотропных агентов и детергентов для оптимального лизиса и денатурации геномной ДНК;
3.        Нейтрализующий буфер – для стабилизации pH раствора;
4.        Промывочный раствор – для промывки нуклеиновых кислот от клеточных метаболитов и солей;
5.        Элюирующий буфер – для элюции и хранения нуклеиновых кислот, pH=8,9;
6.        РНКаза А – для удаления РНК;
7.        Спин-колонки – для сорбции НК.

Скачать краткую инструкцию "Plasmidex Midi" (pdf)

Скачать полную инструкцию "Plasmidex Midi" (pdf)

Подготовка растворов
Добавить весь объем РНКазы А в ресуспендирующий буфер.
Oпционально: для повышения срока хранения растворов, РНКаза А может добавляться в образец индивидуально в объеме 5 мкл после внесения ресуспендирующего буфера.

Проведение процедуры выделения плазмидной ДНК

Лизис
1.   В пробирки объёмом 15 мл внести 10 мл ночной бактериальной клеточной культуры и центрифугировать в течение 6 минут при 3-5 тыс. об/мин. Удалить супернатант. При необходимости повышения концентрации целевого продукта повторить операцию, добавляя к осадку клеток свежую бактериальную культуру с общим объемом культуры до 15 мл.
2.   Добавить к осадку 1 мл ресуспендирующего буфера, перемешать на вортексе или пипетированием до полного разрушения конгломерата клеток.
3.   Внести 1 мл лизирующего буфера. Перемешать с помощью плавного переворачивания пробирки или плавным пипетированием до прозрачности раствора. Инкубировать в течение 2-3 минут при комнатной температуре. Не вортексировать.
4.   Добавить 1,5 мл нейтрализующего буфера. Перемешать с помощью плавного переворачивания пробирки или плавным пипетированием до образования творожистой взвеси. Не вортексировать. Инкубировать при комнатной температуре в течение 3-5 минут.
Сорбция и осаждение НК
1.   Центрифугировать пробирки в течение 30 минут на максимальной скорости.
2.   Не задевая осадок, перенести 3 мл супернатанта в подготовленную спин-колонку.
3.   Центрифугировать спин-колонки в течение 1 минуты при макс. об/мин. Удалить фильтрат из собирательных пробирок.
Промывка НК
1.   Добавить 3 мл промывочного раствора и центрифугировать образцы в течение 1 минуты при макс. об/мин. Удалить фильтрат из собирательных пробирок.
2.   Повторить пункт 1.
3.   Вернуть спин-колонки в собирательные пробирки. Центрифугировать пробирки в течение 1 минуты при макс. об/мин для удаления остатков промывочного раствора.
Элюция НК
1.   Утилизировать собирательные пробирки, перенести спин-колонки в новые пробирки объемом 15 мл.
2.   Нанести в центр мембраны спин-колонок 250 мкл элюирующего буфера, инкубировать в течение 2-5 минут при комнатной температуре.
3.   Центрифугировать пробирки в течение 1 минуты при макс. об/мин.
4.   Утилизировать спин-колонки.

Буферы набора «Plasmidex Midi» могут храниться при комнатной температуре в течение 12 месяцев с даты выпуска изготовителя. В случае наличия осадка при минимальных температурах хранения растворы следует нагреть до комнатной температуры.
Фермент РНКаза А хранится при -20℃.
После добавления РНКазы А в ресуспендирующий буфер полученный раствор следует хранить при +4℃ не более 6 месяцев.
Полученные растворы плазмидной ДНК могут храниться до 7 дней при температуре от +2℃ до +4℃ и до двух лет при температуре -20℃.

Oпционально: для повышения срока хранения растворов, РНКаза А может добавляться в образец индивидуально в объеме 5 мкл после внесения ресуспендирующего буфера.