Подготовка растворовДобавить весь объем РНКазы А в ресуспендирующий буфер.
Oпционально: для повышения срока хранения растворов,
РНКаза А может добавляться в образец индивидуально в объеме 2 мкл после внесения ресуспендирующего буфера.
Проведение процедуры выделения плазмидной ДНК
Лизис1. В пробирки объёмом 2 мл внести 1,5-2 мл ночной бактериальной клеточной культуры и центрифугировать в течение 3 минут при 3-5 тыс. об/мин. Удалить супернатант. При необходимости повышения концентрации целевого продукта повторить операцию 1-2 раза, добавляя к осадку клеток свежую бактериальную культуру с общим объемом культуры до 5 мл.
2. Добавить к осадку 300 мкл ресуспендирующего буфера, перемешать на вортексе или пипетированием до полного разрушения конгломерата клеток.
3. Внести 300 мкл лизирующего буфера. Перемешать с помощью плавного переворачивания пробирки или плавным пипетированием до прозрачности раствора. Инкубировать в течение 2-3 минут при комнатной температуре.
Не вортексировать.
4. Добавить 400 мкл нейтрализующего буфера. Перемешать с помощью плавного переворачивания пробирки или плавным пипетированием до образования творожистой взвеси.
Не вортексировать. Инкубировать при комнатной температуре в течение 3-5 минут.
Сорбция и осаждение НК1. Центрифугировать пробирки в течение 10 минут на максимальной скорости.
2. Не задевая осадок, перенести 750 мкл супернатанта в подготовленную спин-колонку.
3. Центрифугировать спин-колонки в течение 30 секунд при 13 тыс. об/мин. Удалить фильтрат из собирательных пробирок.
Промывка НК1. Добавить 700 мкл промывочного раствора и центрифугировать образцы в течение 30 сек при 13 тыс. об/мин. Удалить фильтрат из собирательных пробирок.
2. Повторить пункт 1.
3. Вернуть спин-колонки в собирательные пробирки. Центрифугировать пробирки в течение 1 минуты при макс. об/мин для удаления остатков промывочного раствора.
Элюция НК1. Утилизировать собирательные пробирки, перенести спин-колонки в новые пробирки объемом 1,5-2 мл.
2. Нанести в центр мембраны спин-колонок 50 мкл элюирующего буфера, инкубировать в течение 2-5 минут при комнатной температуре.
3. Центрифугировать пробирки в течение 30 секунд при макс. об/мин.
4. Утилизировать спин-колонки.