Подготовка растворовДобавить весь объем РНКазы А в ресуспендирующий буфер.
Oпционально: для повышения срока хранения растворов,
РНКаза А может добавляться в образец индивидуально в объеме 5 мкл после внесения ресуспендирующего буфера.
Проведение процедуры выделения плазмидной ДНК
Лизис1. В пробирки объёмом 50 мл внести 40-50 мл ночной бактериальной клеточной культуры и центрифугировать в течение 10 минут при 3-5 тыс. об/мин. Удалить супернатант.
2. Добавить к осадку 5 мл ресуспендирующего буфера, перемешать на вортексе или пипетированием до полного разрушения конгломерата клеток.
3. Внести 5 мл лизирующего буфера. Перемешать с помощью плавного переворачивания пробирки или плавным пипетированием до прозрачности раствора. Инкубировать в течение 2-3 минут при комнатной температуре.
Не вортексировать.
4. Добавить 7 мл нейтрализующего буфера. Перемешать с помощью плавного переворачивания пробирки или плавным пипетированием до образования творожистой взвеси.
Не вортексировать. Инкубировать при комнатной температуре в течение 3-5 минут.
Сорбция и осаждение НК1. Центрифугировать пробирки в течение 40 минут на максимальной скорости.
2. Не задевая осадок, перенести 10 мл супернатанта в подготовленную спин-колонку.
3. Центрифугировать спин-колонки в течение 1 минуты при макс. об/мин. Удалить фильтрат из собирательных пробирок.
Промывка НК1. Добавить 5 мл промывочного раствора и центрифугировать образцы в течение 1 минуты при макс. об/мин. Удалить фильтрат из собирательных пробирок.
2. Повторить пункт 1.
3. Вернуть спин-колонки в собирательные пробирки. Центрифугировать пробирки в течение 1 минуты при макс. об/мин для удаления остатков промывочного раствора.
Элюция НК1. Утилизировать собирательные пробирки, перенести спин-колонки в новые пробирки объемом 50 мл.
2. Нанести в центр мембраны спин-колонок 1 мл элюирующего буфера, инкубировать в течение 2-5 минут при комнатной температуре.
3. Центрифугировать пробирки в течение 1 минуты при макс. об/мин.
4. Утилизировать спин-колонки.